[胶原蛋白]胶原蛋白-明胶复合支架材料修复周围神经缺损

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刘天丹,等.胶原蛋白-明胶复合支架材料修复周围神经缺损 www.

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thickness and percentage of nerve tissues in the experimental group were significantly lower than those in the control group (P< 0.05). There were no significant differences in the conduction velocity, latency of motor nerves and the

conduction velocity and amplitude of sensory nerves between groups (P> 0.05). The amplitude of motor nerves and the latency of sensory nerves in the experimental group were significantly lower than those in the control group (P< 0.05). To conclude, the collagen-gelatin scaffold holds a good cytocompatibity and is ideal for the repair of peripheral nerve defects.

Subject headings: Collagen; Gelatin; Peripheral Nerves; Tissue Engineering

Cite this article: Liu TD, Zhang BC, Hao ML. Collagen-gelatin scaffolds for the repair of peripheral nerve defects. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(2):286-290.

0引言Introduction

周围神经损伤是日常生活中发生较高的创伤性疾病,且随着经济的不断发展,使得工伤、交通事故引起的周围神经损伤发生率呈现上升趋势。从人体解剖学角度来说,由于周围神经结构、功能的特殊性,多数患者损伤后无法在直视下完成神经的对拉吻合,并且损伤的远端神经纤维容易引起瓦勒变性,导致肢体感觉缺失、活动障碍及功能丧失,而神经断裂、神经缺损又是最为严重的损伤类型。目前,临床上对于周围神经缺损尚缺乏理想的修复方法,自体神经移植是周围神经缺损的“金标准”,该方法在临床上取得了理想的治疗效果。但由于修复治疗时存在造成供区受损、来源有限、供受神经不匹配等问题,使其难以在临床上应用[1-2]。而同种异体神经移植修复时则需要使用免疫抑制剂,并且移植成功率相对较低[3-4]。

随着医疗技术的不断发展,以天然细胞外基质为原料制备神经修复支架成为研究的新方向[5-6]。由于周围神经损伤后,远端神经发生瓦勒变性,近端轴突发出的轴芽在间充质干细胞间隙向前滑行,长到远端Bungner 带中,并向靶器官生长形成突触接触,引起许旺细胞增殖,使得轴突髓鞘化,完成神经再生过程[7]。目前,构建支架的材料类型相对较多,如:聚合物、聚乙烯醇、脱乙酰壳多糖等。文献报道显示,胶原蛋白-明胶支架材料属于是一种天然高聚合材料,具有良好生物相容性,能根据周围神经缺损的范围随意塑性[8],但该结论尚未得到进一步证实,并且对于胶原蛋白-明胶支架的制备方法也缺乏统一的标准,更多的学者致力于设计和制备大孔的、生物可降解的、适合神经组织工程的多聚物支架材料[9]。

实验探讨胶原蛋白-明胶复合支架材料制备方法及其在周围神经缺损中的应用效果。

1材料和方法Materials and methods

1.1设计细胞观察实验,动物体内观察实验。 1.2时间及地点实验于2013年12月至2015年12月郑州大学第一附属医动物实验中心完成。 1.3材料

实验动物:6-8周龄SD 大鼠22只,体质量200-250 g,雌雄随机,由郑州大学第一附属医动物实验中心提供,饲养严格遵守相关标准进行饲养,合格证号为许可证号:合格证号为SCXK(豫)2007-0010,两组SD 大鼠均行等条件喂

ISSN 2095-4344CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH

养,且动物处理符合《关于善待实验动物的指导性意见》规则[10]。其中2只用于制备骨髓间充质干细胞;另20只采用随机对照方法分为对照组和实验组,每组10只。

主要仪器和试剂:Ⅰ型胶原蛋白、明胶(美国Sigma-aldrich 公司) ;透射电镜(日本JEM-2000EX 型) ;Keypoint 4C 型肌电图仪(丹麦Dantec 公司) ;XL-30ESEM 扫描电镜(荷兰PHILIPS 公司) ;戊巴比妥钠(上海化学试剂公司) ;常规手术器械(上海医疗器械厂) ;专业动物实验台(中科院上海细胞所) 。 1.4实验方法

1.4.1胶原蛋白-明胶复合支架的制备称取150 mgⅠ型胶原蛋白及75 mg 明胶,将其溶于醋酸中,4 ℃下 18 000 r/min离心90 min,负压抽真空后4 ℃冰箱下过夜,制作成凝胶状悬浊液,将悬浊液注入内径为3 mm 、长 10 cm的硅胶管中,顺轴采用微型调速仪以2×10-5 m/s速度浸入冷凝剂中,放置在-40 ℃调节下冻干48 h ,获得胶原蛋白-明胶复合支架材料,密封、消毒后备用[11-12]。将悬浊液-硅胶管冷冻物放入预冷的铝盘中,于-40 ℃条件中冻干48 h,即可制得干燥成形的胶原蛋白-明胶复合支架材料。材料用戊二醛交联,60Co 消毒密封备用。

1.4.2骨髓间充质干细胞的分离与培养采用断颈方法处死SD 大鼠,充分暴露骨髓腔,采用PBS 冲洗二三次后,加入0.84%NH4Cl 溶液离心10 min ,去除上层清液,加入DMEM 培养液制作成单细胞悬液,将其接种在培养箱中,每周换液3次,待细胞融合85%时进行传代培养[13-14]。利用传代方法收集细胞,加入0.25%胰酶消化后,1 000 r/min离心5 min ,加入500 μL磁珠分选洗涤,2 000 r/min离心 10 min,每107个细胞中加入100 μL Buffer悬浮细胞,加入鼠FcR 阻断剂,4 ℃下混合均匀反应10 min ,加入磁珠抗体,4 ℃下混合15 min,加入适当流式分选Buffer 悬浮混匀后,流式细胞仪完成干细胞的鉴定。

1.4.3骨髓间充质干细胞与支架复合将第5代骨髓间充质干细胞胰酶消化后,制作成单细胞悬液,以1×109 L -1的浓度注入胶原蛋白-明胶复合支架内,培养5 d,隔天换液[15]。观察骨髓间充质干细胞与胶原蛋白-明胶复合支架的复合形态。

1.4.4SD 大鼠周围神经缺损模型的制作及分组处理入选SD 大鼠均禁食12 h,术前肌肉注射0.5 g阿托品,采用3.6%水合氯醛进行全身麻醉,待麻醉生效后进行消毒、铺

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